远场荧光显微技术普遍应用于生命科学研究领域。标准的远场荧光显微技术的分辨率受衍射极限公式 d=/(2NA)所限制。其中，λ是入射光的波长，NA为物镜的数值孔径。

受激发射损耗（STED）显微技术克服了衍射极限问题，该技术利用钛宝石和固体半导体激光组合，将图像分辨率提升到了大分子水平。这项崭新的远场荧光纳米显微技术，已经应用于很多前沿科学研究中，特别是生命科学领域。在标准实验条件下，一组强度足以激化荧光体的脉冲激光，通过物镜聚焦到衍射极限的光影，与另一组STED光束重叠。

STED光束的中心为零能量，周围是很陡的能量边沿，其横截面的形状像中空的甜香饼。STED光束与激化光束同步或相差数皮秒到达同一焦平面；激化光束迅速“熄灭”被STED激化的分子；随后，把STED光束波长微调到荧光体光谱的红光边沿，同时将脉冲频宽调整在荧光体发光时段内，即1～5ns，效果最为理想。

荧光染色分子发射的机率随着STED的脉冲能量而降低；基于此现象，染色分子发射荧光的能力将受次衍射中心光环范围的约束，规范了显微镜的有效“点扩散函数”（Point Spread Function，PSF）。观察样品衍射极限以外的范围，可以通过激光扫描显示样品的全貌。

如果能量强度Is可以把50%荧光体强度降低，它的半高全宽（FWHM）在焦平面的有效“点扩散函数”PSF大约为r ≈ λ/(2NA1+I/Is)，典型的有机染剂强度Is值大约为10～30MW/cm2。

松散的三重态（Triplet-state Relaxation，简称T-Rex）或松散的黑暗态（Dark-state Relaxation，简称D-Rex）STED显微技术是高效的改良型STED显微技术，也是目前为止能提供最高分辨率的显微技术。其原理是降低或消除光漂白现象，其中重点是避免产生三重态。实际上，就是确保两个连续脉冲波的时段大于荧光体所激化的超稳定黑暗态的平均存在时间。由于这种黑暗态存在的平均时间在微秒量级，只要脉冲的重复频率小于1MHz，就可以确保这种黑暗态在随后的两个连续脉冲到达前松散。光漂白是产生黑暗态的主要因素，松散的三重态能减低荧光染剂的光漂白的形成；从计量的角度看，就是促使I/Is有更大比值、而使r值更小。

建立一个松散的三重态和波长可调的激化耗损的激光设定，一般通过锁模的钛宝石激光光源，从震荡器泵浦一个可再生的放大器，再输入一个光纤参量放大器（OPA）来提供所需的可见光波长。整套设备成本通常超过50万美元。另外，这套设备所提供的脉冲在200～300fs之间，而STED显微技术需要宽度在0.1～2ns之间的脉冲。要缩小脉冲频宽差距，需要安装光栅和其他光学元件，随之也会增加系统复杂性，并会涉及到经常性的检查和系统维护，这也使STED显微技术变成了“贵族化”技术。

2006年德国马克斯·普朗克协会（Max Planck Institute）使用高能量超连续激光器提供激化和STED光源，为开发高效、经济实用的STED显微技术打开了大门。一台高能量超连续激光器，价格只是钛宝石固体激光器的1/5，它可以直接实现T-Rex STED显微技术，将图像分辨率有效提高到30～50nm水平。高能量超连续激光光源，在大约20nm的带宽范围内，能量强度大于20nJ，STED光束中心焦点缩小到10-9cm2以内，中心焦点范围的能量强度I也达到数个GW/cm2。

实验设计

图1显示了STED显微镜的设计图。Fianium公司提供的SC450-PP-HE超连续激光光源，其光束的带宽、脉冲、仪器反应函数（IRF）等参数均符合STED显微技术的要求。激化和STED光束来源于同一共振器，所以基本同步，无需调整。除了激光光源和共轭焦显微镜所需的光学元件外，STED纳米显微镜的设计只需添加一些在市场上可以购买到的光学元件，就完全可以运作了。

图1：STED纳米显微镜的设计。使用带宽可调的超连续单一光源，将STED显微技术中所需的激化和损耗光束最佳化。

实验讨论

图2是通过图1的设计，只使用一般的有机染剂所撷取的图像。图片显示，使用共轭焦显微技术的图像不大清晰，而STED显微技术则把哺乳类细胞的微管状组织和稠密的纳米粒子的图像分辨率提升到30～50nm水平，超过光学衍射极限8～9倍。实验结果证明，T-Rex STED显微技术（或称为“远场荧光纳米显微技术”）可以通过一台超连续激光器来实现，其获得的图像分辨率足以满足诸多科研领域的应用需求。目前的设计，只将超连续光源的一半能量用于了STED光源，将来可以考虑引用余下的能量作为Z轴的激化光源，或者用作设计另外色谱的频道。预期超连续光源的应用将拓展到发射蓝光和绿光的染剂，这意味着大部分荧光染剂，都可以应用于T-Rex STED显微技术。

图2：用共轭焦显微技术和STED显微技术所获得的图像对比。实验样品为管状细胞组织 （免疫标记）。

为了满足科研市场对显微技术的需求，超连续激光光源的各种参数将不断优化，以配合不同的荧光染剂和光学元件的使用，从而使STED显微技术能切实地普及到各个科研领域。

参考文献：
1. STED microscopy with supercontinuum laser source, Dominik Wildanger, Eva Rittweger, Lars Kastrup and Stefan W. Hell, 23 June 2008/Vol.16, No. 13/OPTICS EXPRESS 9614.
2. STED application notes, Fianium Ltd., www.fianium.com.